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              产品展示Products
              无内毒素质粒大量试剂盒
              无内毒素质粒大量试剂盒
              更新时间:2019-04-18
              访问量: 777
              厂商性质: 生产厂家

              无内毒素质粒大量试剂盒其内毒素水平控制在 0.1 EU/礸 以下。

              无内毒素质粒大量试剂盒产品概述:

              AxyPrep 无内毒素质粒大量试剂盒

               

              本试剂盒采用 SDS 碱裂解法,结合 DNA 制备膜选择性吸附 DNA。同时采用特殊溶液(Buffer ETR 和 Buffer PF)有效去除内毒素,可从 80-200 ml 细菌培养物中提取出多至 500 高纯度质粒 DNA,其内毒素水平控制在 0.1 EU/ 以下。

               

               

               

              一、 试剂盒组成、贮存、稳定性

               

               

              Cat. No.

              AP-MX-EP-2

              AP-MX-EP-10

              AP-MX-EP-25

               

              制备次数

              2 preps

              10 preps

              25 preps

               

              制备管(Maxiprep column

               

              2

               

              10

               

              25

               

              大量滤器(Maxiprep syringe filter

               

              2

               

              10

               

              25

               

              RNase A

              48 µl

              270 µl

              700 µl

               

              Buffer S1

              24

              ml

              115

              ml

              285

              ml

               

              Buffer S2

              24

              ml

              115

              ml

              285

              ml

               

              Buffer S3K

              24

              ml

              115

              ml

              285

              ml

               

              Buffer B

              24

              ml

              115

              ml

              285

              ml

               

              Buffer W1

              3

              ml

              160

              ml

              350

              ml

               

              Buffer W2 concentrate

              15

              ml

              66

              ml

              150

              ml

               

              ET-free water (70% Ethanol)

              1.8

              ml

              7.5

              ml

              18

              ml

               

              Eluent A

              8

              ml

              30

              ml

              70

              ml

               

              Buffer ETR

              10

              ml

              50

              ml

              120

              ml

               

              Buffer PF

              3

              ml

              13

              ml

              30

              ml

               

              说明书

               

              1

               

              1

               

              1

              RNase A:50 mg/ml,室温可贮存 6 个月,长期贮存于-20℃。
              Buffer S1:细菌悬浮液。加入 RNase A 后,混合均匀,4℃贮存。
              Buffer S2:细菌裂解液(含 SDS/NaOH),室温密闭贮存。
              Buffer S3K:中和液,室温密闭贮存。
              Buffer B:DNA 结合溶液,室温密闭贮存。
              Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
              Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,按试剂瓶上的体积加入无水乙醇(可用无水乙醇或 95%
              乙醇)。混合均匀,室温密闭贮存。
              ET-free water (70% Ethanol):使用前,按试剂瓶上的体积加入无水乙醇(可用无水乙醇或 95%
              乙醇)。混合均匀,室温密闭贮存。
              Eluent A:洗脱液。室温密闭贮存。
              Buffer ETR:内毒素去除液。室温密闭贮存。

              二、 注意事项

              1.细菌过量将影响细菌裂解、质粒 DNA 的释放,导致内毒素含量过高。

              2.步骤 3 和步骤 4 的操作必须温和。剧烈摇晃将导致基因组 DNA 的污染。但混合必须充分,否则影响得率。

              3.在加入 Buffer S3K 时,蛋白质和基因组 DNA 形成粘稠的白色絮状沉淀,必须充分混合均匀,使凝集块中间也得到充分中和凝结。

              4.Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和防护眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣物,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

              三、 实验准备

              1.*次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4℃贮存。

              2.*次使用前,Buffer W2 concentrate 中加入体积的无水乙醇。

              3.*次使用前,ET-free water (70% Ethanol)中加入体积的无水乙醇。使用前置于-20℃预冷。

              4.使用前,检查 Buffer S2 是否出现沉淀,如出现沉淀,应于 37℃温浴加热溶解并冷却至室温后使用。

              5.Eluent A 在 65℃预热后使用,有利于提高质粒得率。

              6.Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃预冷。

              7.准备无核酸和核酸酶污染的 Tip 头、50ml 离心管。

              8.水平离心机(转速可达到 4,000×g)及冷冻离心机(转速可达到 8,000×g)

              9.准备 56℃水浴。

              Buffer PF:分相缓冲液。室温密闭贮存。

              四、 操作步骤

              1.取 80-200 ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),3,000 ×g 离心 8 min,弃上清。将离心管倒置于纸巾上 1 min,除尽上清。
              一般过一夜培养的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之间。若菌液 OD600 >4,菌量需减少。

              2.加 10 ml Buffer S1,悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。

              确认 Buffer S1 中已加入 RNase A。

              3.加 10 ml Buffer S2,温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。
              Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖,以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,降低溶菌效率。
              避免剧烈摇晃,否则将导致基因组 DNA 污染。
              此步骤不宜超过 5 min。

              4.加 10 ml 4℃预冷的 Buffer S3K,温和并充分地上下翻转混合,直至溶液颜色均一并形成紧实的凝集块,室温放置 5 min。
              加入 Buffer S3K 后应立即混合,以避免形成局部的凝结块。

              避免剧烈摇晃,否则将导致基因组 DNA 污染。

              5.加 10 ml 4℃预冷的 Buffer B,温和并充分地上下翻转混合 10 次,8,000×g 离心(4℃)10 min。

              步骤 6-9 可以选择离心法或负压法。

              A.离心法:

              6A. 先将大量制备管放入 50 ml 离心管中。吸取步骤 5 中的混合液,转移到大量滤器(Maxiprep

              syringe filter)中。

              7A. 插入推杆,垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中,≥6,000×g 离心 5 min。 8A. 弃滤液,加 12 ml Buffer W1 至制备管中,≥6,000×g 离心 5 min。
              9A. 弃滤液,加 14 ml Buffer W2 至制备管中,≥6,000×g 离心 5 min。

              确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。

              B.负压法:

              6B. 正确连接负压装置,将大量制备管插到负压装置的插口上。

              7B. 吸取步骤 5 中的上清液,转移到大量滤器中,插入推杆,垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中,开启并调节负压至-25 ~ -30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。

              8B. 保持负压,加 12 ml Buffer W1,吸尽管中溶液。

              9B. 保持负压,加 14 ml Buffer W2,吸尽管中溶液。

              确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。

              10.再在大量制备管中加 4 ml Buffer W2,≥6,000×g 离心 5 min。

              11.将制备管置于另一洁净 50 ml 离心管中,在制备管膜中央加 2 ml Eluent A,室温静置 5 min,≥6,000

              ×g 离心 5 min 收集质粒 DNA。

              将 Eluent A 加热至 65℃将提高洗脱效率。

              12.弃制备管。在滤液中加入 4 ml 预冷的 Buffer ETR,混合均匀。

              如果 Buffer ETR 浑浊,于冰上静置,直至溶液变得清亮;如果分层,则混合均匀。


              13.加入 1 ml Buffer PF,混合均匀。

              *溶液可能会出现微弱的浑浊现象,此为正常现象。

              14.置于 56°C 孵育 8 min。室温 4,000×g 离心 5 min。

              孵育后溶液将出现大量乳白色沉淀,否则延长孵育时间。

              孵育后溶液有可能出现分层现象,此为正常现象。
              此步骤的离心必须使用吊篮式(swing-out rotor)离心机或其他水平离心机

               

              15.取无色上相至 50 ml 离心管中,加入 0.8 倍体积异丙醇(如:取得 6 ml 无色上相,则加入 4.8 ml 异丙醇),混合均匀。室温静置 10 min。8,000×g 离心 10 min。
              16.尽可能弃尽上清。加入 2 ml 预冷的 ET-free water(70% Ethanol),洗涤沉淀,8,000×g 离心 5 min。

              ET-free water(70% Ethanol)使用前确定已加入体积的无水乙醇。


              17.尽可能弃尽上清。在超净台中干燥 10-15 min。

              管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。


              18.加入 500 祃 Eluent A 或无内毒素水溶解质粒 DNA。

              总抗氧化能力(total antioxidant capacity,t-aoc)试剂盒说明书

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